Hydrofobinen pylväskromatografia

Hydrofobinen vuorovaikutuskromatografia(HIC) on tehokas tekniikka, jota käytetään pääasiassa proteiinien, etenkin niiden, joilla on hydrofobisia ominaisuuksia, erottamisessa ja puhdistamisessa. Tämä kromatografinen menetelmä hyödyntää näytteen molekyylien ja kiinteän vaiheen välisiä hydrofobisia vuorovaikutuksia, mikä mahdollistaa komponenttien erottamisen niiden siirtymisnopeuksien perusteella eluution aikana liikkuvan vaiheen kanssa. Tässä kattavassa artikkelissa pohdimme hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian periaatteita, käyttöä, sovelluksia, etuja, haittoja ja viimeaikaisia ​​edistyksiä.

HIC: n perusta on proteiinimolekyylien ja paikallaan olevaan vaiheeseen kiinnitettyjen hydrofobisten ligandien välisissä hydrofobisissa vuorovaikutuksissa. Proteiinit, jotka ovat luonteeltaan amfipaattisia, sisältävät sekä hydrofiilisiä että hydrofobisia tähteitä. Vesipitoisissa liuoksissa hydrofiilisillä tähteillä on taipumus kohdata ulospäin, vuorovaikutuksessa vesimolekyylien kanssa, kun taas hydrofobiset tähteet haudataan usein proteiinin tertiääriseen rakenteeseen. Tietyissä olosuhteissa, kuten korkeiden suolakonsentraatioiden esiintyminen, nämä hydrofobiset tähteet voivat kuitenkin paljastua, mikä edistää niiden vuorovaikutusta hydrofobisten ligandien kanssa kromatografisessa matriisissa.

HIC: n liikkuva faasi koostuu tyypillisesti puskuroidusta suolaliuoksesta, jonka pH -alue on 6-8. Hydrofobisten vuorovaikutusten parantamiseksi käytetään korkeita suolapitoisuuksia helpottaen proteiinien sitoutumista paikallaan olevaan vaiheeseen. Suolakonsentraation asteittainen vähentäminen liikkuvassa vaiheessa eluution aikana lisää pesuvoimaa, jolloin proteiinit voidaan eluoitua niiden hydrofobisuuden perusteella. Proteiinit, joilla on heikommat hydrofobiset vuorovaikutukset, eluoivat ensin, mitä seuraa ne, joilla on voimakkaampi vuorovaikutus.

Hydrofobisen pylväskromatografian metodologia sisältää useita tärkeitä vaiheita, mukaan lukien näytteen valmistelu, pylvään tasapainotus, näytteen lataaminen, eluutio ja fraktioiden keräys.

◆ Näytteen valmistelu:
Ennen näytteen lataamista pylvääseen on välttämätöntä valmistaa näyte lisäämällä riittävästi suolaa liikkuvan vaiheen A (tasapainopuskurin) suolakonsentraation vastaiseksi. Näyteliuoksen pH on myös säädettävä adsorptio -olosuhteiden täyttämiseksi.

◆ Pylväs tasapainotus:
Pylväs on tasapainotettu liikkuvalla vaiheella A, joka on puskuroinut suolaliuos, jolla on spesifinen pH ja suolakonsentraatio. Tämä varmistaa, että paikallaan oleva faasi on kyllästetty puskurilla, joka on valmis vuorovaikutukseen näyteproteiinien kanssa.

◆ Näytteen lataaminen:
Valmistettu näyte ladataan pylvääseen. Näytteen tilavuuteen vaikuttavat väliaineen komponenttipitoisuus ja sitoutumiskyky. Laimennettujen näytteiden suora kuormitus on mahdollista ilman aikaisempaa konsentraatiota.

◆ Elution:
Eluutio saavutetaan vähentämällä siirrettävän faasin suolapitoisuutta vähitellen, heikentäen siten proteiinien ja paikallaan olevan vaiheen hydrofobisia vuorovaikutuksia. Vaihtoehtoisesti eluointi voidaan saavuttaa lisäämällä orgaanisia liuottimia tai pesuaineita liikkuvaan vaiheeseen sen napaisuuden muuttamiseksi tai sitoutuneiden proteiinien syrjäyttämiseksi.

◆ Fraktioiden kokoelma:
Eluidut fraktiot kerätään ja analysoidaan kohdeproteiinien puhtauden ja palautumisen arvioimiseksi.

Useat tekijät vaikuttavat merkittävästi proteiinien erotustehokkuuteen ja puhtauteen hydrofobisessa pylväskromatografiassa:

◆ Suolan pitoisuus ja tyyppi:
Suolan tyypillä ja konsentraatiolla liikkuvassa vaiheessa on keskeinen rooli hydrofobisten vuorovaikutusten moduloinnissa. Suoloja, kuten ammoniumsulfaattia ja natriumkloridia, käytetään yleisesti, pitoisuudet vaihtelevat 0. 75 - 2 mol/l ammoniumsulfaatille ja 1 - 4 mol/l natriumkloridille.

◆ PH:
Liikkuvan vaiheen pH vaikuttaa proteiinien varaustilaan ja hydrofobisuuteen. PH: n päässä proteiinin isoelektrisestä pisteestä pyrkii edistämään eluutiota vähentämällä hydrofobisia vuorovaikutuksia.

◆ Lämpötila:
Pylvään lämpötilan lisääminen voi parantaa hydrofobisia vuorovaikutuksia, mikä johtaa parannettuun erotustehokkuuteen.

◆ Virtausnopeus:
Virtausnopeus vaikuttaa pylvään proteiinien viipymisaikaan, mikä vaikuttaa niiden vuorovaikutukseen kiinteän vaiheen kanssa.

◆ Pylväsominaisuudet:
Pylvään pituus, halkaisija ja pakkausmateriaali edistävät erottelutehokkuutta. Kiinteän vaiheen materiaalin valinta ja sen pintaominaisuudet ovat myös kriittisiä.

HIC löytää laajan levityksen erilaisten proteiinien, mukaan lukien seerumiproteiinit, membraaniin sitoutuneet proteiinit, ydinproteiinit, reseptorit ja rekombinanttiproteiinit. Sen lempeät erotusolosuhteet tekevät siitä erityisen sopivan aktiivisten aineiden, kuten entsyymien, vasta -aineiden ja muiden terapeuttisten proteiinien, puhdistamiseen.

Edut:

1) Korkeat palautumisnopeudet: HIC tarjoaa korkeat proteiinien palautumisnopeudet, mikä tekee siitä tehokkaan suurten puhdistusprosessien kannalta.

2) Ylläpitää proteiiniaktiivisuutta: Lievät erotusolosuhteet minimoivat proteiinien denaturoinnin ja aktiivisuuden menetyksen.

3) Monipuolisuus: HIC voidaan mukauttaa laajan proteiinien puhdistamiseksi, joilla on vaihtelevia hydrofobisia ominaisuuksia.

Haitat:

1) Rajoitettu liukoisuus: Joillakin proteiineilla voi olla vähentynyt liukoisuus korkeilla suolakonsentraatioilla, rajoittaen niiden sovellettavuutta HIC: ssä.

2) Suolan häiriöt: Suuret suolapitoisuudet liikkuvan faasin voi häiritä seuraavia analyyttisiä vaiheita, mikä edellyttää ylimääräisiä suolanpoistomenetelmiä.

Viimeaikaiset HIC: n edistysaskeleet ovat keskittyneet uusien kromatografisten matriisien kehittämiseen, joilla on parantunut erotustehokkuus ja stabiilisuus. Hydrofiilisen vuorovaikutuskromatografian (HIIC) periaatteiden ja sekoitusmoodin hartsien käyttö on laajentanut HIC: n sovellettavuutta napayhdisteiden erotukseen.

Lisäksi HIC: n integrointi muihin kromatografisiin tekniikoihin, kuten ioninvaihtokromatografia tai kokoerottelu kromatografia, on helpottanut tehokkaampien ja vankempien puhdistusprotokollien kehitystä. Automaation ja korkean suorituskyvyn seulontatekniikoiden edistysaskeleet ovat myös vaikuttaneet HIC-prosessien skaalautuvuuteen ja toistettavuuteen.

HIC -tutkimuksen tulevaisuuden suuntiin sisältyy vaihtoehtoisten ligandien ja matriisien tutkiminen erottelutehokkuuden parantamiseksi ja sovellusten laajuuden laajentamiseksi. Ympäristöystävällisempien ja kestävämpien liikkuvien vaiheiden kehittäminen sekä eluutio-olosuhteiden optimointi proteiinien denaturoinnin minimoimiseksi on edelleen jatkuvaa tutkimusta.

Yhteenvetona voidaan todeta, että hydrofobinen vuorovaikutuskromatografia edustaa monipuolista ja tehokasta työkalua proteiinien, etenkin niiden, joilla on hydrofobisia ominaisuuksia, erottamiseen ja puhdistamiseen. Hyödyntämällä näytteen molekyylien ja kiinteän vaiheen välisiä hydrofobisia vuorovaikutuksia HIC mahdollistaa korkealaatuisten proteiinien puhdistamisen erilaisille terapeuttisille, diagnostisille ja tutkimussovelluksille. Kromatografisten materiaalien, automatisoinnin ja integroinnin jatkuvien edistysaskeleiden avulla HIC: n tulevaisuus lupaa vielä suuremman tehokkuuden ja laajemman sovellettavuuden biofarmaseuttisten aineiden alalla.

Suositut Tagit: Hydrofobinen pylväskromatografia, Kiinan hydrofobinen pylväskromatografia Valmistajat, toimittajat, tehdas